محلول فایکول 100 سی سی

محلول فایکول 100 سی سی mbio
جداسازی سلولهای تک هسته ای خون محیطی
Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) isolation
روش کار:قبل از باز کردن به مدت یک الی دو دقیقه شیک کنید یا روی روتاتور قرار بدید. -1ابتدا حجم 5 میلی لیتر خون EDTA# شده از هر نمونه را در فالکون تیوب 15 میلی لیتری را با نسبت یک به یک (50%-50%) با 5 میلی لیتر PBS برای دریافت غلظت مناسب رقیق می کنیم . سپس دو تا سه بار فالکون را سرو ته می نمایٔیم .
-2 مقدار 5 میلی لیتر محلول فایکول را در لوله مشابه دیگری ریخته و سپس بوسیله پیپت پاستور و پیپتور خون رقیق شد . در مرحله قبل را به آهستگی و به شکلی که با محلول فایکول مخلوط نشود از کنار دیواره و به آرامی روی سطح فایکول می ریزیم.
نکته: نباید خون رقیق شده با محلول فایکول ترکیب شود و می بایست خون روی سطح فایکول قرار گیرد.
-3سپس فالکون را در سانتریفیوژ یخچال دار قرار داده با دمای 20 تا 18 درجه سانتیگراد و دور 400 g و برای حداکثر 4دقیقه سانتریفیوژ می کنیم تا لایه های مختلف براساس شیب چگالی جدا شوند.
نکته: در صورتیکه از زمان خونگیری بیش از 2 ساعت گذشته باشد، می بایست مدت زمان سانتریفیوژ را افزایش داد.
-4 پس از انجام سانتریفیوژ فالکون حاوی لایه های متمایز به ترتیب از بالا به پایین شامل : پلاسما (زردرنگ)، Buffy Coat )حلقه شیری رنگ کدر)، فایکول (شفاف) و گلبولهای قرمز (قرمز تیره ) می باشد. بوسیله پیپت پلاستیکی یا سمپلر و با دقت کامل، حلقه شیری رنگ و کدر بین سرم و فایکول را جدا کرده و به لوله ای دیگر منتقل می کنیم.
نکته: حلقه شیری رنگ کدر Buffy Coat حاوی سول های PBMC می باشد.
-5به نمونه Buffy Coat جدا شده تا حجم 10 میلی لیتر ،PBS اضافه می کنیم.
-6فالکون حاوی Buffy Coat و PBSرا در دمای 4 تا 6 درجه سانتیگراد برای مدت 5 دقیقه و با دورrpm 1400 در سانتریفیوژ یخچال دار سانتریفیوژ می کنیم ( مرحله شستشو)
-8سلولهای ته نشین شده را جداسازی نموده و برای انجام مراحل بعد به میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری منتقل می نماییم.